О силовом воздействии на ДНК в модели Пейрарда-Бишопа-Доксуа

1. Введение

ДНК является одной из ключевых молекул жизни, обеспечивающей хранение и передачу генетической информации. Однако её структура не статична: молекула ДНК подвергается различным механическим и тепловым воздействиям, что может приводить к её локальной или глобальной денатурации. Изучение процессов разрыва водородных связей в двойной спирали под влиянием внешних сил важно для понимания биологических механизмов, таких как репликация и транскрипция, а также для разработки нанотехнологических применений [1–9].

Одним из подходов к моделированию динамики ДНК является модель Пейрарда–Бишопа–Доксуа (ПБД) [10,11], которая упрощает представление структуры ДНК, рассматривая последовательность пар нуклеотидов как одномерную цепочку нелинейно связанных осцилляторов, где каждая пара оснований моделируется как точечная масса, взаимодействующая с соседними парами через потенциал, учитывающий водородные связи и стэкинг-взаимодействия. Данная модель позволяет эффективно анализировать процессы плавления и механической денатурации ДНК в различных внешних условиях [12–14] .

В настоящей работе исследуется поведение ДНК при низких температурах под действием внешних сил, направленных на поперечное растяжение цепи.

Наши результаты углубляют понимание механического поведения двойной спирали ДНК, предлагая молекулярно-динамические подходы, основанные на использовании столкновительного термостата Балабаева–Лемака [15–17] (см. Приложение A), непосредственно применимые в биофизических исследованиях, а также в развивающихся областях ДНК-нанотехнологий и устройств на основе наноструктур.

Исследование проводится при температурах, близких к T = 0 K. В отличие от работ [18–20], посвященных динамике пузырей, рассматриваемое нами состояние можно считать квазиравновесным с практически отсутствующим тепловым движением из-за низкой скорости растяжения. Рассмотрению конечных температур планируется посвятить отдельную статью.

В данной работе используется прямое одномерное моделирование молекулярной динамики. В отличие от работы [21], в которой потенциалы аппроксимировались рядом Тейлора, мы используем исходные выражения для потенциалов.

Моделирование молекулярной динамики раскручивания двойной спирали ДНК под действием направленной внешней силы имеет фундаментальное значение для интерпретации и прогнозирования широкого спектра биологических и нанотехнологических процессов, включая работу ДНК-хеликаз при репликации и транскрипции, механическое разделение цепей в экспериментах с одномолекулярными оптическими и магнитными ловушками, а также процесс управляемого вытягивания и распознавания последовательности ДНК в устройствах для нанопорового секвенирования [22–25]. Численное изучение зависимости критической силы разрыва от точки приложения и скорости растяжения [26] позволяет не только количественно описать энергетические барьеры, связанные с разрывом водородных связей и стэкинг-взаимодействий в различных контекстах [27], но и выявить такие ключевые особенности процесса, как ступенчатый характер денатурации и гистерезис при циклическом воздействии силы [28], что непосредственно связано с термодинамической эффективностью молекулярных машин [29] и механической стабильностью ДНК-наноструктур, разрабатываемых для применений в наномедицине и синтетической биологии [30].

Работа организована следующим образом. В разделе 2 описана модель. В разделе 3 проанализированы данные, полученные в вычислительных экспериментах по растяжению ДНК под действием постоянной внешней силы. Раздел 4 отвечает на вопрос о том, является ли процесс растяжения обратимым. Раздел 5 посвящен выводам.

2. Материалы и методы

Мы рассматриваем динамику ДНК с использованием модели ПБД. В этой модели после исключения движения центра масс каждая пара нуклеотидов представляется единой точечной массой.

Гамильтониан модели ПБД имеет вид [10, 11]

где:

Мы выбираем общую эффективную массу как M = 300.5 а.е.м.; остальные параметры взяты из работы Кампа и Джансанти: β = 0.35 Å^–1, k = 0.025 эВ/Ų, ρ = 2.0, D_AT = 0.05 eV, α_AT = 4.2 Å^–1, D_GC = 0.075 эВ, α_GC = 6.9 Å^-1 [12].

В этой модели:

• M представляет собой эффективную массу пары нуклеотидов,
• D_n и α – это глубина и обратная ширина потенциальной ямы, описывающей взаимодействие комплементарных нуклеотидов,
• параметр k соответствует коэффициенту упругости, учитывающей стэкинг-взаимодействия,
• β – постоянная затухания этих взаимодействий,
• ρ – безразмерный коэффициент, описывающий кооперативность денатурации в π-стэке [7].

Суммирование выполняется по всем N парам нуклеотидов. В модели ПБД величина y_n отражает относительное смещение нуклеотидов n-й пары из их равновесного положения. В этой модели y_n соответствует фактическому удлинению водородных связей в комплементарной паре оснований, умноженному на $\sqrt{2}$ (см [31]).

Первый член в (1) описывает кинетическую энергию колебаний. Второй член – это потенциал Морзе (U_Morse), моделирующий водородные связи между нуклеотидами в паре оснований. Третий член соответствует стэкинг-взаимодействию (U_stack) соседних пар оснований [10].

Если действует внешняя сила, гамильтониан ПБД должен включать член:

где F – внешняя сила, вызывающая смещение y на любом сайте цепи.

3. Результаты моделирования

Для моделирования воздействия кантилевера на ДНК использовался метод моделирования молекулярной динамики в её одномерном варианте. Потенциал был представлен уравнениями (2) и (3) для интерсайтового и межсайтового взаимодействий. Также была добавлена внешняя сила F = k·Δy (где k – жесткость кантилевера, а Δy – удлинение пружины кантилевера). Уравнения движения интегрировались с использованием скоростного алгоритма Верле. Температура поддерживалась с помощью термостата Лемака–Балабаева [15–17] (см. также Приложение A).

Движение кантилевера всегда было медленнее, чем динамические процессы разрыва связей в цепи.

Кратко опишем результаты моделирования силового воздействия при низких температурах. Существуют различные способы приложения силы к молекуле ДНК. Мы ограничимся рассмотрением двух экспериментальных случаев, в которых внешняя сила F приложена к концевым сайтам молекулы ДНК (рис. 1.2) и к среднему сайту (рис. 1.1), где y – это отклонение от равновесия между парами нуклеотидов в точке приложения силы F.

Внешняя сила F, приложенная к молекуле, возникает от пружины, соединяющей терминальный сайт с определённой точечной массой – кантилевером. Кантилевер движется с постоянной скоростью. Если константа жесткости пружины стремится к бесконечности, то терминальный сайт, к которому приложена сила, также будет двигаться с той же постоянной скоростью.

Для рассматриваемой модели (1) сила F состоит из суммы двух сил: F = F_Morse + F_stack, где F_Morse – сила Морзе, определяемая вторым членом в правой части формулы (1), F_stack – стэкинг-сила (сила Доксуа), определяемая третьим членом в правой части формулы (1).

Если сила приложена к среднему сайту, стэкинг-сила примерно в 2 раза больше, чем сила, приложенная к терминальному сайту, поскольку терминальный сайт имеет только одну соседнюю пару нуклеотидов, в то время как любой нетерминальный сайт имеет две (см. Приложение B).

На рис. 2 показаны типичные зависимости как компонент F_Morse, F_stack, так и суммарной силы F, действующей на ДНК, от смещения y в точке приложения силы.

Здесь представлена зависимость силы от смещения для модели с фиксированным положением остальной части цепи. Это позволяет получить приблизительную оценку для критической силы F_c, приводящей к расстегиванию цепи. На основе графика 2 значение силы в точке максимума для рабочих параметров [12] составляет 187 пН, если растяжение происходит на терминальном сайте, и 209 пН, если растяжение происходит на любом серединном сайте.

Типичная зависимость силы от смещения y для незафиксированной цепи показана на рис. 3, где F → 0 при y → ∞.

На рис. 3 показано распределение силы по сайтам цепи из пяти пар оснований для F < F_c при значениях параметров цепи из [12]. F_c – это критическая сила, при которой цепь расстегивается; она совпадает с максимальной силой, прилагаемой кантилевером.

Для первого сайта (если этот сайт терминальный – слева) эта сила равна по модулю и противоположна по знаку сумме сил F_Morse1 (сила от потенциала Морзе) и F_stack12 (сила межсайтового взаимодействия, действующая со стороны второго сайта):

В свою очередь, F₂, действующая на второй сайт, равна F₂=F_Morze2+F_stack21, где F_Morse2 – сила от потенциала Морзе, F_stack21 — сила межсайтового потенциала, действующая со стороны первого и третьего сайтов.

Для любого сайта с номером m из внутренней части цепи полная сила будет равна:

Выбор константы жесткости пружины кантилевера не влияет на максимумы сил F_c, полученные при T = 0 K. Это не так при температурах, отличных от 0 K. В Приложении B показано, что выбор константы жесткости пружины влияет только на динамику ДНК после прохождения каждого пика силы.

На рисунках 4 и 5 показаны результаты моделирования раскручивания цепи в двух случаях: когда сила приложена к терминальному сайту цепи (рис. 4) и к центральному сайту (рис. 5). Пилообразные кривые на рисунках 4 и 5 соответствуют последовательному разрыву стэкинг-связей с увеличением y (и, соответственно, с увеличением времени). Почти вертикальные линии на рис. 4 показывают, что процессы разрыва связей происходят очень быстро (порядка нескольких пикосекунд; см. Приложение C).

Согласно [26], значение F_c, когда точка приложения силы находится далеко от концов цепи, равно 239.43 пН, а когда сила приложена к терминальному сайту, F_c составит 226.48 пН. Разница в значении составляет 12.95 пН.

Расчеты в данной работе показывают, что как на терминальный, так и на средний сайт действует одна сила внутрисайтового потенциала Морзе (168.3 пН) и одна (в случае терминального сайта) сила межсайтового потенциала (18.7 или 19.5 пН, в зависимости от конца ДНК 3' или 5'), либо две силы межсайтового потенциала (18.7 пН + 19.5 пН = 38.2 пН). Таким образом, для терминального сайта получается сила 187 пН в случае 3'-конца и 187.8 пН в случае 5'-конца. Если тянуть за средний сайт, сила составит 206.5 пН.

4. Гистерезис

В данном разделе мы рассмотрим вопрос: что произойдет, если воздействовать на систему кантилевером периодически? Будет ли силовая характеристика ДНК на обратном пути точно такой же, как и при растяжении?

Рассмотрим квазистатическое периодическое движение кантилевера. Выберем в качестве периода 1 мкс. Предположим, что кантилевер движется полпериода в направлении растяжения ДНК и полпериода в направлении исходного состояния так, чтобы цепь не расстёгивалась. Таким образом, после одного полного периода (или n полных периодов, где n – натуральное число), кантилевер будет находиться в координате Y_cant = 0 Å.

Тогда зависимость силы от времени и от координаты будет выглядеть следующим образом:

В этом случае интеграл силы вдоль контура гистерезиса определяет потерю энергии Q цепью ДНК за один цикл гистерезиса:

Для оценки интеграла (7) проводится циклический эксперимент: в течение 1 мкс цепь растягивается на 10 Å с разрывом водородных связей между парами оснований, а затем в течение следующей 1 мкс сжимается. При этом водородные связи возникают вновь. Сила, прилагаемая кантилевером при растяжении молекулы, больше, чем при её сжатии. Под «сжатием» здесь понимается обратное движение кантилевера, а не силовое сжатие.

Потери на гистерезис приводят к нагреву цепи, что необходимо учитывать при создании структур для генерации механических колебаний в ДНК.

Если Q₁ – энергия, затраченная кантилевером при растяжении ДНК, а Q₂ – энергия, полученная кантилевером при его обратном ходе, то Q = Q₁ – Q₂. Соответственно, для используемых нами параметров коэффициент полезного действия (КПД) будет:

Отметим, что расчет КПД приведен для конкретного случая. Если бы для того же образца был выбран другой период растяжения-сжатия, эффективность могла бы быть иной.

5. Выводы

В данной работе проведено численное исследование динамики разрыва двойной спирали ДНК под влиянием внешних сил при низких температурах в рамках модели Пейрарда–Бишопа–Доксуа для значений параметров из [12]. Случай физиологических температур для параметров [12] в условиях термодинамического равновесия рассмотрен в [13]. Мы рассматривали растяжение с постоянной скоростью. Анализ результатов позволил сделать ряд ключевых выводов.

Выявлено, что разрыв двойной спирали ДНК происходит ступенчато, причём первые разрывы требуют значительно больших сил, чем последующие. Это связано с особенностями распределения сил между парами нуклеотидов.

Установлено, что для параметров Кампа критическая сила, необходимая для инициации разрыва, составляет примерно 210 пН, что согласуется с ранее опубликованными данными. Однако дальнейшее увеличение приложенной силы до 266 пН приводит к лавинообразному процессу денатурации.

При приложении силы, обеспечивающей постоянную скорость растяжения, на графике зависимости силы от времени наблюдаются характерные пики, что свидетельствует о последовательном разрыве отдельных участков цепи.

Обнаружено, что механизмы денатурации варьируются в зависимости от прикладываемого внешнего воздействия: при постоянной силе наблюдается внезапное удлинение цепи, тогда как при постоянной скорости процесс протекает более равномерно.

Медленное движение кантилевера приводит к быстрым динамическим изменениям в цепи.

Микросекундное периодическое движение кантилевера приводит к пикосекундной динамике в цепи.

Многочисленные примеры воздействия силы на ДНК можно найти в живых клетках, где двуцепочечную ДНК и свёрнутую РНК перемещают и расстёгивают ферменты [32]. Другой пример – расстёгивание ДНК в нанопорах, что важно в установках для секвенирования генома в процессах захвата и протягивания ДНК через нанопоры [23–25, 33]. Таким образом, эксперименты по расстёгиванию в сочетании с теоретическими методами позволили описать резкий переход при расстёгивании и термодинамику мотивов РНК или ДНК-шпилек [34, 35]. Наше молекулярно-динамическое моделирование может лечь в основу описания таких процессов.

В частности, мы продемонстрировали, что колебания кантилевера в терагерцовом диапазоне частот будут сопровождаться значительными тепловыми потерями. Рассчитан КПД конкретного цикла растяжения-сжатия ДНК с использованием кантилевера.

Результаты работы могут быть полезны для дальнейшего изучения механической стабильности ДНК, а также для разработки методов контролируемой денатурации в биотехнологических и нанотехнологических применениях.